人雙鏈RNA(dsRNA)ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)操作全流程指南
一、試劑盒核心原理與組成
人雙鏈RNA(dsRNA)ELISA試劑盒采用雙抗體夾心法檢測原理，通過特異性抗體捕獲和顯色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對dsRNA的定量檢測。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病理學(xué)研究、免疫機(jī)制探索以及mRNA疫苗質(zhì)量控制等科研領(lǐng)域。
1. 檢測原理
包被抗體：微孔板預(yù)包被抗dsRNA抗體作為捕獲抗體
樣本孵育：樣本中的dsRNA與捕獲抗體形成復(fù)合物
檢測抗體：加入HRP標(biāo)記的二抗形成"抗體-dsRNA-酶標(biāo)抗體"復(fù)合物
顯色反應(yīng)：TMB底物在HRP催化下產(chǎn)生顏色變化，顏色深度與dsRNA濃度正相關(guān)
定量分析：450nm波長測定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度
2. 試劑盒組成
典型試劑盒包含以下組分：
預(yù)包被微孔板(12孔×8條)
dsRNA標(biāo)準(zhǔn)品(通常400ng/L原液)
30倍濃縮洗滌液(20mL)
HRP酶標(biāo)試劑(6mL)
樣品稀釋液(6mL)
顯色劑A/B液(各6mL)
終止液(6mL)
封板膜(2張)
二、樣本采集與處理規(guī)范
1. 適用樣本類型
本試劑盒適用于多種生物樣本中dsRNA的檢測：
血清/血漿：EDTA抗凝血漿為佳，避免使用肝素抗凝(可能干擾檢測)
細(xì)胞培養(yǎng)上清：需3000×g離心10分鐘去除細(xì)胞碎片
組織勻漿：按1:9比例加入PBS勻漿后離心取上清
病毒培養(yǎng)物：需先進(jìn)行核酸提取純化
2. 樣本處理要點(diǎn)
離心條件：所有液體樣本需3000×g離心10分鐘澄清
保存要求：短期可存于-20℃，長期應(yīng)置于-80℃，避免反復(fù)凍融(≤3次)
避免干擾：樣本中NaN3濃度需<0.1%，避免抑制HRP活性
溶血影響：嚴(yán)重溶血樣本可能導(dǎo)致假陽性，應(yīng)重新采集
3. 特殊樣本處理
對于mRNA疫苗等生物制品中的dsRNA檢測：
需根據(jù)修飾類型(pUTP、N1-Me-pUTP等)選擇對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品
建議進(jìn)行梯度稀釋(通常1:10-1:100)確保濃度在線性范圍內(nèi)
高濃度樣本可能出現(xiàn)"鉤狀效應(yīng)"，需驗(yàn)證稀釋線性
三、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作流程
1. 試劑準(zhǔn)備
平衡溫度：所有試劑使用前需室溫(25±3℃)平衡30分鐘
洗滌液配制：將30×濃縮液按1:29比例用蒸餾水稀釋
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：通常設(shè)7個(gè)梯度(如220、110、55、27.5、13.75、6.875、3.4375ng/L)
酶標(biāo)試劑：直接使用無需稀釋，避免反復(fù)凍融
2. 檢測步驟
加樣：每孔加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本，設(shè)空白對照
孵育：37℃溫育60分鐘，避免震動
洗滌：棄液后每孔加300μL洗滌液，靜置30秒棄去，重復(fù)5次
加酶標(biāo)：每孔加100μL HRP標(biāo)記抗體，37℃孵育30分鐘
顯色：加入TMB底物100μL，37℃避光反應(yīng)15分鐘
終止：每孔加50μL終止液，輕輕混勻
讀數(shù)：5分鐘內(nèi)于450nm測OD值(參考波長630nm)
3. 質(zhì)量控制
標(biāo)準(zhǔn)曲線：R²值應(yīng)≥0.99，各點(diǎn)CV<15%
復(fù)孔檢測：建議樣本做雙復(fù)孔，孔間差異應(yīng)<20%
板間驗(yàn)證：每板應(yīng)包含高低兩個(gè)濃度質(zhì)控品
空白值：OD450應(yīng)<0.15，否則需檢查污染
四、結(jié)果分析與解讀
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，采用四參數(shù)擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。典型檢測范圍為4-220ng/L，靈敏度可達(dá)1pg/mL。
2. 濃度計(jì)算
直接計(jì)算：樣本OD值代入曲線方程求得濃度
稀釋樣本：最終濃度=測定值×稀釋倍數(shù)
臨界值：S/CO≥1判為陽性(S為樣本OD，CO為cut-off值)
3. 異常結(jié)果處理
高值樣本：OD值超過最高標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測
低值樣本：OD值低于低標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)可報(bào)告"<檢測下限"
非線性稀釋：提示可能存在基質(zhì)干擾，需進(jìn)行回收率驗(yàn)證
五、常見問題解決方案
1. 實(shí)驗(yàn)操作問題
洗滌不充分：導(dǎo)致背景高，需確保每次洗滌液浸泡30秒以上
氣泡干擾：加樣時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，讀數(shù)前可短暫離心
2. 試劑相關(guān)問題
顯色異常：顯色液變藍(lán)表明污染，應(yīng)更換新批次
結(jié)晶析出：濃縮洗滌液可37℃水浴溶解后使用
板條受潮：未用板條應(yīng)立即放回鋁箔袋密封保存
注：以上資料僅供參考，完整操作請以實(shí)說明為準(zhǔn)，不同品牌可能存在細(xì)節(jié)差異。
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